C4-1 コムギ無細胞系を用いた複合体タンパク質の生産及び低分子抗体作製

タンパク質発現 、抗体作製 、複合体構造解析、相互作用解析、相互作用パートナー探索、薬剤探索アッセイ系構築・スクリーニング

[1] 支援担当者

[2] 支援技術の概要

• コムギ無細胞タンパク質合成系を用いた発現困難なタンパク質の生産。

• 無細胞共発現系による複合体タンパク質合成。
• プロテインアレイを用いた複合体パートナー解析。最大2万5千種のヒトタンパク質を搭載したヒトプロテインアレイ。他に、プロテインキナーゼ、転写因子、RING型E3リガーゼ、GPCR、イオンチャネルのフォーカスドアレイも提供可能。


• 複合体タンパク質のX線結晶構造解析。タグ挿入、Fabを用いた構造安定化技術。
• 独自に開発した3種類のタンパク質精製システム。（AGIA-TEV法、CP5精製システム、BISOP法）
• 無細胞膜タンパク質大量合成技術。数mgの膜タンパク質を短期間に生産。免疫抗原等に使用実績あり。

• 抗体遺伝子単離（ISAAC法）。リンパ球チップを用いて、１細胞のBリンパ球からヒト抗体、マウス抗体、ウサギ抗体の遺伝子を単離し、リコンビナントモノクローナル抗体を迅速に作製することができる。

• リコンビナントFab抗体の直接発現技術。パパインを用いたFabの作製法では、末端が不均一であった。我々の方法では、末端が完全に揃ったFabが得られる。タンパク質の構造解析におけるシャペロンバインダーとして有用。
• サメシングルドメイン抗体（VNAR）作製技術。哺乳動物から進化的に遠いサメへの免疫、小さく安定なVNAR生産。（2019年度後期より支援開始予定）

[3] 支援技術の利用例

• 機能解析あるいは構造安定化を目的とした複合体パートナー探索
• 結晶化・クライオ電子顕微鏡解析のための高純度タンパク質試料調製
• 抗膜タンパク質抗体の作製のための無細胞系を用いた膜タンパク質抗原大量合成
• FabまたはVNARを用いた複合体安定化・結晶性改善
• 自己免疫疾患の患者末梢血リンパ球からモノクローナル自己抗体遺伝子を単離
• 作製困難なモノクローナル抗体の作製（例：リン酸化ペプチド、GPCR など）

[4] 支援担当者の研究概要

コムギ無細胞タンパク質合成技術の開発（澤崎・竹田）
無細胞系とは試験管内でタンパク質の翻訳を行う技術である。私たちが開発したコムギ無細胞系は非常に高い翻訳効率をもち、ヒトのタンパク質をはじめ、ほとんどの原核生物・真核生物のタンパク質の合成が可能。無細胞系は解放系なので、複数のmRNA鋳型を同時に添加でき、複合体タンパク質の合成に有利である。また、脂質小胞リポソームを系に添加することでGPCRやイオンチャネルなどの膜タンパク質を合成することができる。

プロテインアレイを用いた複合体パートナー探索（澤崎・竹田）
コムギ無細胞系の高い合成効率は少量多検体のタンパク質調製に最適。私たちは数百から最大2万種のタンパク質のセット、プロテインアレイを作製した。AlphaScreen技術を用いて開発した相互作用スクリーニングアッセイ系により、標的タンパク質の相互作用相手をプロテインアレイの中から探索することが可能である。プロテインアレイはマイクロタイターウェルに個別のタンパク質が搭載されており、濃度もほぼ一定であるため、相互作用をクリアに検出することができる。

ISAAC法を用いたモノクローナル抗体の迅速作製と創薬への応用（小澤）
今までに、ウイルスに対して中和活性を持つヒト抗体、自己免疫疾患患者由来の自己抗体、GPCRに対するウサギ抗体など、様々な抗原に対して、数多くの抗体を作製してきた。これらの抗体を用いて、ウイルス感染症の治療、自己免疫疾患発症メカニズムの解明、GPCRを標的とした創薬開発などの研究を行っている。

タンパク質複合体の構造解析（宮川）
コムギ無細胞系、昆虫細胞等の宿主、高圧リフォールディング技術等により生産した、ヒト疾患関連タンパク質、植物ホルモン受容体タンパク質、有用物質合成酵素等の構造解析を行ってきた。X線結晶構造解析を基盤に多様な構造生命科学の手法を利用し、創薬を含む医農工分野への応用のため、分子構造に基づく生命現象の理解に取り組んでいる。