C1-1 クライオ電子顕微鏡法のための膜タンパク質複合体の生産と試料調製技術

膜タンパク質複合体の発現と精製、クライオ電子顕微鏡観察用試料調製、界面活性剤除去法

[1] 支援担当者

[2] 支援技術の概要

• 昆虫細胞や動物細胞を用いてターゲットとなる真核生物由来膜タンパク質複合体を大量発現。



• 膜タンパク質複合体精製標品の品質を評価する蛍光ゲル濾過法や負染色電子顕微鏡法。



• 膜タンパク質複合体のクライオ電子顕微鏡用試料の作製効率を上げる界面活性剤除去法とブロッティング法。



• オンサイトクオリティチェックが可能な膜タンパク質複合体を高分解能単粒子解析するためのクライオ電子顕微鏡。

[3] 支援技術の利用例

• 真核生物由来膜タンパク質複合体の発現と精製の最適化
  ギャップ結合チャネルの発現・精製を昆虫細胞と哺乳動物細胞で行っている。サブタイプによって細胞系を使い分けている。


• 界面活性剤除去法GraDeRによって、膜タンパク質複合体を変性させずにフリーのミセルを除去。
  光合成エネルギー変換の膜タンパク質複合体において、GDNを用いたGraDeRを行って、粒子の分散性のよいクライオグリッドの作製に成功した。


• 昆虫細胞を用いた哺乳類の時計タンパク質の大量発現
  概日時計の機能を変化させるユニークな化合物の作用機序の解明を目指し、化合物とその標的タンパク質との複合体のX線結晶構造解析を試みている。対象となる哺乳類の時計タンパク質を昆虫細胞において大量発現し、安定供給する系を構築することに成功した。

[4] 支援担当者の研究概要

• 膜タンパク質複合体のクライオ電子顕微鏡用試料調製法の技術開発
  クライオ電子顕微鏡用試料（グリッド）作製において、膜タンパク質複合体の精製標品に含まれる界面活性剤の除去法のほか、多様な膜タンパク質複合体に対応したグリッド作製法を探索している。例えばGraDeR(Gradient based Detergent Removal)はグリセロールの密度濃度勾配超遠心法を用いたフリーの界面活性剤ミセルを除く手法である（Hauer and Gerle et al., Structure 23, 1769-1775(2015)）。最近ではナノディスク、amphipolといった手法も手掛けている。


• 膜タンパク質複合体の高分解能単粒子解析
  グリッド作製の最適化から、膜タンパク質複合体といった難易度の高い試料のクライオ電子顕微鏡による高分解能単粒子解析を目指している。特にギャップ結合チャネルのinnexinやconnexinを中心とした対称性の高い膜タンパク質複合体を中心に、複数の試料調製法を用いて構造解析に取り組んでいる(Oshima et al., Nat. Commun. 7, 13681 (2016))。線虫に存在するギャップ結合チャネルinnexin-6は、可溶化状態とナノディスク再構成状態で構造解析に成功している。
  　哺乳動物細胞による大量発現系を用いて、プロトンポンプH⁺,K⁺-ATPaseの構造研究をX線や電子線を用いて行っている。特にX線結晶構造解析から、H⁺,K⁺-ATPaseがどのようにして胃の中にpH 1という強酸性溶液を作り出しているかが理解できた (Abe et al., Nature 556, 214-218 (2018))。