B1-4 SPring-8:温湿度制御（HAG法）による生理活性状態での構造変化の解析

非凍結状態での回折実験、抗凍結剤の影響を低減した結晶凍結

[1] 支援担当者

所属		①高輝度光科学研究センター
氏名		①馬場 清喜、熊坂 崇
AMED 事業	ユニット／領域名 課題名	構造解析ユニット（構造解析領域） 創薬等ライフサイエンス研究のための相関構造解析プラットフォームによる支援と高度化 (SPring-8/SACLAにおけるタンパク質立体構造解析の支援および高度化)
	代表機関 代表者	理化学研究所 山本 雅貴
支援技術のキーワード		非凍結回折実験、HAG法、温度湿度制御

[2] 支援技術の概要

　構造ダイナミクス解明に向けた構造多様性解析の実現に向けて、温湿度制御による生理活性条件での活性構造解析、SACLAと連携した生理活性条件での測定用条件スクリーニングの支援を行う手法・装置を提供する。

・非凍結状態での回折実験を実現する手法
　タンパク質結晶は、水溶性高分子によりコーティングし、湿度制御する（Humid Air and Glue coating method：HAG法）ことで、非凍結状態で安定に質を保持した回折実験が実現できる[1]。

さらに、HAG法でマウントした結晶は、抗凍結剤の影響を低減した凍結操作も可能である。

(参考)

[1] Baba et al. Acta Cryst D69, 1839-1849 (2013).

[3] 支援技術の利用例

利用例1
Rasタンパク質は、細胞のがん化に関連して、その構造と機能の研究が進められている。
　その一種であるH-Rasは、HAG法でマウントし湿度制御することにより、結晶内で構造変化が誘導された。この結果、下流シグナル伝達タンパク質と結合するスイッチ領域が開いた構造の解析が可能となった[2]。

(参考)
[2] Matsumoto et al. Sci. Rep., 6, 25931(2016).

利用例2
　銅アミン酸化酵素は、様々な生物種に幅広く存在しており、一級アミン類をアルデヒドとアンモニアに分解する活性を持っている。その活性中心には、銅イオンと補酵素トパキノンを含んでおり、ヒトの血清中の本酵素は、糖尿病の発症にも関与している。銅アミン酸化酵素の結晶を温度制御ワークベンチ内でハンドリングしてHAG法でマウントし、調温調湿装置による温度・湿度制御環境下で回折実験を行うことで、非凍結結晶を安定に保ち、天然に近い状態での酵素タンパク質の構造変化を明らかにした。結晶温度を精密にコントールすることにより、酵素が働くときに起きる構造変化の熱力学解析に成功した[3]。

(参考)
[3] Murakawa et al. Proc Natl Acad Sci USA, 116, 135-140 (2019).

[4] 支援担当者の研究概要

生理活性条件（室温など）のタンパク質から多様な状態の構造解析を行うために、手法・装置の開発を進めている。現在は、右に示す装置が利用可能である。さらに、以下の研究開発を行っている。
・温度制御調湿条件下での精密高速データ収集
　より高精度での温度・湿度制御が可能となる調温調湿装置、より安定な温度環境を実現する温度制御ハンドリングワークベンチの高性能化を進めると供に、測定の自動化、高速化に向けた開発も進めている。

・高速顕微分光測定の測定システムの開発
　生理活性条件での変化をリアルタイムに観察するために、オンラインで、より高速な測定を可能とする顕微分光装置を開発する。

・BMBL高輝度化の取り組み
　より短時間での測定は、高効率な実験が可能となる。そこで、分光器内結晶の非対称化などを導入し、高輝度化を進めている。[4]

(参考)
[4] Baba et al. AIP Conf Proc, 2054, 060008 (2019).